高志卿1,高志敏2,张俊3,陈以平4
 

　　[摘要]目的:观察屎酸性肾摘大鼠肾脏中整合素a5、整合素pl的mRNA表达及扑肾活血方对其影响,为肾问质纤维优的防治挺供依据.方法:采用酵母、腺曝睁制作屎酸性肾病大鼠模型,直用RT-PCR法,动态观察犬鼠肾脏中整合素α5、整台素β1的mRNA表达及补肾活血方对其影响.结果:造模第4周末时整合素a5、整合素β1的mRNA在屎酸性肾病大鼠肾组织中的表达增加,各路药组大鼠予以相应药物泊疗后,整合素mRNA表达有不同程度的降低.结论:补肾活血方对尿酸性肾病大鼠肾脏中整台素α5、整合素β1的mRNA表达的下调可能是其抑制FN沉积、防治肾阀质纤维化的作用机制之一.但不同剂量的补肾活血方对不同整合素mRNA表达麦借有着不同的影响,同时也币存在明显的剂量依赖性量效关系.
　　[关键词]整台素;屎酸性肾病;补肾活血方;大鼠,实验研完
　　[中围分类号]R285.5 [文献标识码]A [文章编号]0257-358X(2007)II'0770-03
　　尿酸是人体内嘌呤代谢的终末产物,由于嘌呤代谢紊乱,血尿酸生成过多或者排泄减少,即形成高尿酸血症,当尿酸盐在血中的浓度呈过饱和状态时即可沉积于肾脏而引起肾脏损害,称之为尿酸性肾病.我们应用补肾活血方(枸杞子、杜仲指}断、狗脊、补骨脂,桃仁、制大黄等)为基本方治疗本病取得较好疗效.为进一步探讨其作用机制.进行了以下动物实验.
　　1材料与方法,
　　1.1实验动物          SPF缴雄性SD大鼠.体质量200~230 g,购于上海西普尔一必凯实验动物有限公司,许可证号:SCXK(沪)2003-0002,饲养于上海中医药大学实验动物中心SPF级动物室,标准饮食,自由饮水.每笼5只,适应性饲养3 d后用于实验.
　　1.2主要药物及试剂          补肾活血方:药材购于上海中医药大学附属龙华医院中药房,由中国科学院上毒药物研究所加工制备成浸膏.使用时接比例以蒸馏水溶解、稀释.高、低剂量组浓度分别为5.7 g(生药)/ml、2.85 g(生药)/ml.别嘌醇片:上海延安万象药业股份有限公司生产,以蒸馏水溶解、稀释为5 mg/ml.酵母、膑嘌呤、琼脂糖:OxOD公司,购自上海百泰化学科技公司.肌酐、尿素氨、屎酸,黄嘌呤氧化酶测定试剂盒:南京建成生物工程研究所.RNA Trizol一步法提取试剂盒,DNA Ladder:北京鼎国生物技术责任有限公司.EDTA、Tris、硼酸、演化乙啶、溴酚蓝、二甲苯青、焦碳酸二乙酯;sigma公司分装,购自上海申能博彩生物技术有限公司.PCR引物:参照Genebank基因序列,由上海申能博彩生物技术有限公司合成.
　　2实验方法
　　2.1分组与造模    取SD大鼠69只.随机分为5组,其中正常组15只、模型组30只、别嘌醇组8只、补肾活血方高剂量组8只、补肾活血方低剂量组8只,正常组动物给予普通全价饲料.其余动物予以吉10%酵母干粉的饲料(将酵母干粉均匀拌入粉碎的太鼠颗粒饲料中.重新压制成型,酵母干粉含量为10%)喂养.控制酵母的每日摄人量为10 g/kg体质量.并予阱腺嘌呤每天100 mg/kg灌胃.
　　2 2给药剂量    正常组、模型组予以蒸馏东灌胃,别嗓醇组、高剂量组、低剂量组分别于造模同时每天予以别嘌醇(50 mg/kg)、高剂量补肾恬血方[57 g(生药)/kg体质量]、低剂量补肾活血方[28,5 g(生药)/kg体质量]灌胃,灌胃体积均为1 ml/100 g,各组动物自由饮水,共35 d.
　　2.3标本留取第1、3、5周结束时,随机取正常组动物5只,禁食不禁水12 h,然后腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg,腹主动脉取眦,分离血清.-20℃冰箱保存备用,摘取双侧肾脏,迅速称重后.右侧肾脏及112左侧肾脏迅速置于液氮中,转入-80℃冰箱保存备用,剩余1/2肾脏投人福尔马林液中固定.前4周每周结束时,同样方法处死模型组动物各5只.第5周结束时,将剩余动物全部处死,方法同前
　　2.4检测方法       各项生化指标检测采用比色法,试剂盒购于南京建成生物公司.整合素α5、整合素βlmRNA表达:RT-PCR法,凝胶电泳结束后.FR-200紫外与可见光分析系统拍照,并进行电泳条带光密度(灰度)分析.为消除系统及定量误差,各组mRNA表达水平以相对表达量即目的基因/β-action的灰度比值来计算.
　　3统计学处理
　　采用SPSS  Version ll.0 for Windows进行数据统计,以均散±标准差(x士s)表示,组间比较采用One-Way ANOvA分析,统计显著性水平为P 　　4实验结果.
　　4.1一般情况       正常组大鼠体质量增长明显,精神状况良好,动作自如,反应灵敏,体毛有光泽.模型组大鼠体质量减轻,多饮、多尿,体毛干枯、脱落、欠光泽,精神萎缩,活动减少;各给药组动物诸情况相对模型组为轻.
　　4.2死亡情况       实验过程中,正常组大鼠无死亡,模型组大鼠死亡3只,别嘌醇组、高剂量组、低剂量组各死亡1只,无统计学意义.
　　4 3补肾活血方对大鼠各项生化指标变化的影响        与正常组比较,模型大鼠从第1周末即开始出现血尿索氮浓度增高及黄嘌呤氧化酶活性增强,分别P<0.05和P<0.01;血清尿酸浓度于第2周末在散值上升高,但无统计学意义,第4
　　周末出现统计学意义.P<0.05}血清肌酐浓度于第4周末出现显著升高,P 　　予以相应药物治疗后,与正常组比较.给药组大鼠各项生化指标虽仍处于较高水平,P<0.05或P<0.01;但与模型组比较,已有不同程度的降低.其中,各组动物血尿酸浓度均明显降低,P<0.01;血肌酐浓度以补肾括血方高荆量组降低更为明显,P<0.01,黄嘌岭氧化酶活性以别嘌醇组和补肾活血方高剂量组下降更显著,P<0.01尿素氮浓度各组无明显变化,P>O.05.
　　4.4补肾括血方对大鼠肾组织中整台素mRNA表选变化的影响    造模后.整合素α5、整合素β1mRNA在尿酸性肾病大鼠肾组织中的表达在第4周末出现增加,与正常组比较,P

  　　各给药组大鼠予以相应药物治疗后,整合素mRNA表达有不同程度的降低,与模型组比较,别嘌醇组大鼠肾组织中整合素βImRNA表达明显减少,P0.05.见表2. 　　

5讨论
　　与其他哺乳动物不同,人类尿酸氧化酶基因不表达.尿酸是人类嘌呤代谢的终末产物.正常情况下,人类每日产生的尿酸有2/3经肾脏排泄,其余1/3经消化道排泄【1】.高尿酸血症形成后可以导致多种病变,尿酸性肾病仅为其中之一.慢性屎酸性肾病起病隐匿,初期常伴有关节症状或痛风结石,并以蛋白尿、镜下血尿、夜尿额多等为主要表现,晚期病情进一步发展,可出现高血压及氰质血症,最终导致尿毒症.痛风患者约20%~25%并发尿酸性尿路结石,而尸体解剞证实,痛风患者有肾损害者为100 【2】,还有新生儿尿酸性肾病导致急性肾衰的报道【3].
　　对于本病发病机制及治疗,我们认为如下.①气虚肾亏为本,瘀浊阻络为标.尿酸性肾病以禀赋不足,素体脾肾亏虚为内在病理基础,复因饮食不节、嗜食肥甘、贪饮酒装,瘀浊之邪阻滞经脉,聚于肾络,导致气化失司,开舍无权.气血壅滞而发病.本病起病隐匿缓慢,关节痹痛常为首发症状,其病位在肾.涉及脾、肝、膀胱、关节,筋脉等啬多脏腑.瘸变日久,治之不当.可导致肾元衰竭而死亡.②护肾为本,标本兼治:尿酸性肾病为本虚标实、虚实夹杂之证,其发展可分为初期、中期、晚期三个阶段,正虚之本贯穿整个病程.因此在治疗上以扶正为主,并将护肾作为本病的根本治则,同时兼额标实之证,方选具有益气补肾,化瘀降浊功教的补肾活血方.
　　本实验结果表明,模型大鼠血清尿酸水平于第2周开始升高,于第4周后出现统计学意义;血清肌酐水平在前3周无明显变化,第4周后出现明显升高,在时间上晚于血清尿酸的升高;相比之下,尿素氨水平的升高出现较早,其后虽有反复,但当血肌酐开始升高的时候,从数值上看,尿素氮水平的升高更加明显.这些表现均验证了高尿酸血症→尿酸性肾病→肾功能衰竭这一发展过程.
　　补肾活血方通过降低血尿酸浓度而解跺高尿酸血症这一病变基础,表现为各指标的全面好转.高、低剂量补肾活血方降低血尿酸作用均较明显,同时,高剂量补肾活血方对肌酐浓度的影响较为显著,这些均提示同一药物的不同剂量对相同的指标有着不同的作用.由于尿素氮水平受饮食等因素的影响较大,其测定值往往波动较大,本实验中,各给药组动物尿素氨水平与模型组比较虽无统计学差异,但在数值上已有下降趋势,以高剂量补肾活血方组更为明显,有待进一步深入研究.
　　基质成分合成与降解失衡所导致的ECM沉积是肾纤维化的主要病理特征.多种损伤因素均可导致细胞外基质沉积,过蠹的ECM聚积可以导致毛细血管被挤压、闭塞、滤
　　过面积减少,最终导致肾小球硬化的发生及肾功能减退.在肾小球硬化过程中细胞外基质的量、组分及其次序性均发生变化,其中FN的变化最早而且明显.
　　整合素是一娄存在于细胞表面的黏附分子,广泛分布于各种细胞,主要介导绍胞与细胞外基质以及细胞与细胞之同的黏附,进一步谰节多种细胞功能,包括细胞撼亡、细胞增殖、细胞赫附与迁移、淋巴细胞归巢等.整合α5、βl是纤维粘连蛋白的主要受体【4],是纤维粘连蛋白基质形成的关键,为细胞外纤维连接蛋白原纤维与细胞之间提供了重要的接触位点,是肿瘤肾转移发生的重要因素【5】.在IgA肾病患者肾间质中的表达与肾间质纤维化程度密切相关,参与并介导了细胞黏附、细胞与基质成分的相互作用.在慢性进展性肾脏疾病的发病机制中起着重要作用.Korhonen等【7】研究发现.在肾间质纤维化时,整合索a5的表达明显增加.本实验结果显示,整合素西、整合素βlmRNA的表达在第4周末出现增加,与正常组比较,P<0.01.提示我们以α5、βl整合素受体为研究靶点,可能成为控制纤维粘连蛋白过度沉积的有效途径之一.
　　本实验结果显示,整合素a5、β1mRNA的表达在第4周末出现增加,与正常组比较.P0.05.表明不同剂量的补肾活血方对不同整台索mRNA表达变化有着不同的影响,也不存在明显的剂量依赖性量效关系.同时提示,补肾活血方对尿酸性肾病大鼠肾脏中整合素a5、整合素βlmRNA表达的下调可能是其抑制FN沉积、防治肾间质纤维化的作用机制之一.
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